Более быстрый, более эффективный CRISPR, редактирующий у мышей: Electroporation, более эффективный, чем микроинъекция при получении CRISPR-Cas9 в эмбрионы мыши

В то время как CRISPR-Cas9 привлек международное внимание из-за своего потенциала, чтобы исправить простые наследственные болезни в людях, основные исследователи взволнованы его способностью помочь им понять причины и развивать лечение более сложных болезней, включая рак и деменцию.Чтобы сделать это, они должны вывести из строя или изменить определенные гены у животных лаборатории – в частности, мыши – и видеть то, что спутывается. Сегодняшний золотой стандарт для создания этих «нокаутов» или «knockins» должен отредактировать гены внутренние эмбриональные стволовые клетки мыши, использовать эти клетки, чтобы создать мозаичных мышей, и затем скрестить мышей, чтобы получить чистое генетическое напряжение. Из-за способности CRISPR-CAS9 точно измениться или заменить гены, редактирование все больше и больше делается непосредственно в оплодотворенной яйцеклетке или раннем эмбрионе.

Новый метод, названный CRISPR-EZ (CRISPR RNP electroporation зигот), делает редактирование генома в эмбрионах мыши еще легче.«Ключевое фундаментальное понимание о биологическом значении гена обычно прибывает из в естественных условиях редактирующих ген исследований, в которых Вы производите мышей с измененным геном», сказала ведущий исследователь Лин Хэ, адъюнкт-профессор УКА Беркли молекулярных и цитобиологии. «Но это – главная поддержка, чтобы сделать новый нокаут с разработкой генома. Я думаю, что эта технология могла значительно уменьшить технический барьер для этого типа усилия и позволит людям сосредотачиваться больше на науке, а не поглощаться процессом генетически технических мышей».

Новый метод, описанный в выпуске этой недели Журнала Биологической Химии, обходит отнимающее много времени узкое место в создании мышей нокаута: использование микроскопических игл, чтобы ввести редактирующие ген молекулы в оплодотворенную яйцеклетку.Исследователи УКА Беркли нашли, что простой метод лаборатории, названный electroporation, работает намного лучше, позволяя им вставить редактирующие ген молекулы CRISPR-Cas9 в эмбрионы почти с 100-процентным успехом. Электропорэйшн использует толчок электричества, чтобы создать отверстия в эмбрионах, через которые могут войти молекулы.

Используя CRISPR-EZ в экспериментальном эксперименте, Он – команда, успешно разрушенная обе копии целевого гена у 88 процентов мышей. Процедура произвела намного большее число отредактированных мышей по сравнению с микроинъекцией CRISPR, в основном из-за существенного улучшения в жизнеспособности эмбриона. CRISPR-EZ – простая и рентабельная методология, и может быть выполнен на многих эмбрионах сразу и берет только миллисекунды, сказал Он.«В не слишком отдаленном прошлом это стоило бы по крайней мере 25 000$ и заняло бы по крайней мере 6 месяцев, чтобы сделать мышь нокаута», сказал Рассел Ванс, преподаватель УКА Беркли молекулярных и цитобиологии и директора Лаборатории Исследований рака, где трансгенная работа мыши была выполнена. «С CRISPR и улучшениями, такими как CRISPR-EZ, затраты и время оба понизились, по крайней мере, 10-кратный.

Эти технические инновации делают мышь еще более мощным инструментом для моделирования человеческих болезней».Группа УКА Беркли теперь работает с несколькими трансгенными средствами мыши в надеждах, что они примут и улучшат эту electroporation технику, которую она подозревает, также упростит создание других трансгенных млекопитающих.Нокауты требуют команды ЭКО

Создание трансгенных мышей требует квалифицированной команды экстракорпорального оплодотворения. Технический персонал использует гормональные инъекции, чтобы подготовить женщин к спариванию, после которого они получают оплодотворенные яйцеклетки и, прежде чем яйца начнут делить, вводить их по одному использование тонкой иглы. В настоящее время технический персонал вводит две молекулы РНК – РНК посыльного (mRNA), который кодирует для белка Cas9 и РНК руководства, которая обеспечивает адрес для цели CRISPR-CAS9 – и надежда, что mRNA правильно переведен на белок Cas9 и что белок правильно объединяется с РНК руководства.Спроектированные эмбрионы внедрены в ложно беременную мышь, где они gestate в течение приблизительно 20 дней до рождения.

Учитывая неизбежные смертельные случаи эмбриона во время инъекции и отказа эмбрионов внедриться или пойти в термин, темп живорождения низкий, сказал Он.«Фактический процент живорождений от введенных эмбрионов составляет приблизительно 10 – 15 процентов для большинства трансгенных средств, который является проблемой с процедурой», сказала она. «Иногда люди собирают больше чем 100 эмбрионов только, чтобы произвести одну или двух мышей с желательным генным редактированием».

Electroporation, кажется, наносит меньше ущерба эмбрионам, чем микроинъекция: между 30 и 50 процентов эмбрионов привел к живорождениям.По-видимому, также, вставка заранее смонтировала молекулы CRISPR-Cas9 в оплодотворенную яйцеклетку, более эффективный способ отредактировать гены, чем впрыскивание двух молекул – mRNA и вести РНК – и надежда, что они правильно самособираются. Из живорождений у 88 процентов мышей были обе копии целевого отредактированного гена – более высокий показатель успешности чем обычно для трансгенных процедур, сказал Он.Для более сложной процедуры – изменения короткой последовательности ДНК в гене – метод составлял успешные 42 процента времени в экспериментальном эксперименте.

«С таким высоким показателем успешности Вы можете использовать это, чтобы проверить Ваши РНК руководства очень быстро», сказала она. «Если Ваш CRISPR-EZ не работает, это не из-за доставки; это вероятно, потому что Ваш дизайн РНК руководства должен быть улучшен».Высокая жизнеспособность эмбриона и очень высокая редактирующая ген эффективность означают, что исследователи должны использовать меньше мышей и могут провести несколько трансгенных экспериментов одновременно.Случайное открытиеВ ее лаборатории Он учится, маленькие части РНК назвали microRNA, которые изменяют, как ДНК расшифрована, и таким образом управляйте важными процессами в клетке.

Некоторые типы рака были связаны с проблемами с miRNA.Ища более простой способ создать трансгенных мышей, чтобы изучить эти регулирующие процессы, постдокторант Эндрю Модзелевский проверил electroporation, чтобы видеть, мог ли бы он заставить яйца более легко поднимать Cas9 mRNA и РНК руководства. Несмотря на очевидный успех других исследователей с mRNA, его начальные попытки были неудачны.

Однажды вечером, оказываясь из mRNA и не желания потратить впустую подготовленные эмбрионы, он заимствовал белок CRISPR-Cas9 из соседней лаборатории, собрал комплексы RNP и electoporated их вместо этого.«Это работало как волшебство с тех пор», сказал Он. «Вы никогда не думали бы, что это будет работать, потому что Cas9 – гигантская молекула.

Я был удивлен, что такой огромный белок мог быть electroporated эффективно».В то время как у большинства университетов есть трансгенные лаборатории, где микроинъекции сделаны, electroporation упрощает процедуру достаточно, что отдельные лаборатории могли бы в конечном счете сделать это сами, она предсказала.


6 комментариев к “Более быстрый, более эффективный CRISPR, редактирующий у мышей: Electroporation, более эффективный, чем микроинъекция при получении CRISPR-Cas9 в эмбрионы мыши”

  1. Горяинов Богдан

    Он настолько умный, шо думает – та заипали вы в меня сцать!!! :))

  2. Не трыньди, такого не будет. А ты против уплаты налогов? Ты за нелегальные доходы?

  3. Баринов Алексей

    Цены само собой. Но народ то не совсем тупой, по идее они сейчас должны требовать вернуть з/п в гривнах.

Оставьте комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *