«Развитие вариантов Cas9 с более широким диапазоном планирования особенно важно для заявлений, требующих точного планирования геномных последовательностей», говорит Бенджамин Клейнстивер, доктор философии, научный сотрудник в Молекулярной Единице Патологии MGH и лидерстве и co-corresponding авторе статьи Биотехнологии Природы. «Кроме того, кодирующая последовательность SaCas9 на 23 процента меньше, чем тот из SpCas9 – версия, полученная из Стрептококка pyogenes – различие в размере, которое делает SaCas9 выгодный для потенциальных терапевтических применений, требующих доставки вирусами».Нуклеазы CRISPR-Cas9 состоят из короткой молекулы РНК, 20 нуклеотидов которой соответствуют целевой последовательности ДНК и бактериальному ферменту Cas9, который режет ДНК в желаемом месте. Наряду с матчем между последовательностями РНК и ДНК, Cas9 должен признать смежную последовательность нуклеотида, названную protospacer смежным мотивом (PAM).
В предыдущем исследовании, о котором сообщают ранее в этом году по своей природе, команда MGH описала генетическую систему, которая позволила им быстро развить SpCas9, чтобы признать различные последовательности PAM. В то время как естественный SpCas9 признает последовательность PAM формы NGG – в котором N показывает любой нуклеотид, и G – молекула гуанина – команда MGH смогла развить версии SpCas9, которые признают более широкий диапазон последовательностей PAM, по существу удваивая диапазон наводимых мест.В их текущем исследовании команда MGH обратилась к SaCas9, который естественно требует последовательности PAM NNGRRT – в котором R может быть или аденином или гуанином, и T должен быть тимином – смежный с его целевой ДНК.
Используя продвинутую форму молекулярной системы эволюции, описанной в предыдущем отчете, команда MGH преуспела в том, чтобы развивать вариант, который они называют KKH SaCas9, который признает последовательности PAM с любым нуклеотидом в третьем положении, увеличивая их диапазон планирования два – к в четыре раза. Система смогла спроектировать эти изменения в специфике PAM, не требуя предвидения точной структуры фермента SaCas9, что-то, что было неизвестно в то время, когда это исследование происходило.«Мы теперь показали, что наш направленный подход эволюции может использоваться, чтобы изменить специфику PAM SaCas9, значительно расширяя количество геномных мест, к которым может получить доступ эта важная нуклеаза Cas9», говорит Дж. Кит Джунг, Мэриленд, доктор философии, объединенный руководитель Исследования в Отделе MGH Патологии и co-corresponding авторе статьи Биотехнологии Природы. «Способность точно предназначаться для мест важна для исследователей, заинтересованных разрушением маленьких генетических элементов или выполнением исследований, включающих ремонт ДНК соответственной перекомбинацией, обмен нуклеотидами между нитями ДНК, которые лучше всего могут быть достигнуты, когда разрыв ДНК близко к интересному сайту.
Мы полагаем, что наш направленный подход эволюции обеспечивает важный проект изменения свойств признания богатства нуклеаз Cas9, которые существуют у многих бактерий». Джунг – преподаватель Pathology в Медицинской школе Гарварда