DMD – тяжелая мускульная дегенеративная болезнь, вызванная мутацией потери функции в dystrophin гене. Это причиняет каждого 3500-го мальчика и обычно приводит к смерти ранней взрослой жизнью. В настоящее время очень мало доступно с точки зрения лечения пациентов вне паллиативного лечения. Один интерес получения выбора – геномное редактирование TALEN и CRISPR, которые быстро стали неоценимыми инструментами в молекулярной биологии.
Эти ферменты позволяют ученым раскалывать гены в определенных местоположениях и затем изменять остатки, чтобы произвести геномную последовательность для их симпатии. Однако программируемые нуклеазы не нетронутые и часто по ошибке редактируют подобные последовательности, которые изменяют несколько пар оснований от целевой последовательности, делая их ненадежными для клинического использования из-за потенциала для нежеланных мутаций.Поэтому вызванные плюрипотентные стволовые клетки (клетки IPS) являются идеальными моделями, потому что они предоставляют исследователям изобилие терпеливых клеток, на которых можно проверить программируемые нуклеазы и найти оптимальные условия, которые минимизируют нецелевые модификации. Ученые CiRA использовали в своих интересах эту особенность, произведя клетки IPS от пациента DMD.
Они использовали несколько различных TALEN и CRISPR, чтобы изменить геном клеток IPS, которые были тогда дифференцированы в клетки скелетной мышцы. Во всех случаях, dystrophin выражение белка был поправлен, и в некоторых случаях, dystrophin ген был полностью исправлен.
Один ключ к успеху был разработкой вычислительного протокола, который минимизировал риск нецелевого редактирования. Команда строила базу данных что все возможные перестановки последовательностей до 16 пар оснований долго. Среди них они извлекли тех, которые только появляются однажды в геноме человека, т.е. уникальных последовательностях. DMD может быть вызван несколькими различными мутациями; в случае пациента, используемого в этом исследовании, это был результат удаления экзона 44.
Исследователи поэтому построили гистограмму уникальных последовательностей, которые появились в геномном регионе, который содержал этот экзон. Они нашли стопку уникальных последовательностей в экзоне 45.
Согласно Akitsu Hotta, кто возглавил проект и занимает совместные позиции в CiRA и Институте Интегрированного Материаловедения Клетки в Киотском университете, «Почти половина генома человека состоит из повторных последовательностей. Таким образом, даже если мы нашли одну уникальную последовательность, изменение одной или двух пар оснований может привести к этим другим повторным последовательностям, который рискует TALEN или CRISPR редактирование неправильного региона.
Чтобы избежать этой проблемы, мы искали регион, которые совершают нападки высоко в гистограмме."С этой целью команда рассмотрела три стратегии изменить мутацию изменения структуры dystrophin гена: экзон, пропускающий, соединяя экзоны 43 и 46, чтобы восстановить рамку считывания, структура, переходящая, включая вставку или удаление (indel) мутации и удар экзона – в, вставляя экзон 44 перед экзоном 45. Все три стратегии эффективно увеличили dystrophin синтез в дифференцированных скелетных клетках, но только удар экзона – в подходе возвратил ген к своему естественному состоянию.
Значительно, редактирование показало очень высокую специфику, предположив, что их вычислительный подход может использоваться, чтобы минимизировать нецелевое редактирование программными нуклеазами.Кроме того, бумага обеспечивает доказательство принципа для использования клеточных технологий IPS, чтобы рассматривать DMD в сочетании с TALEN или CRISPR. Группа теперь стремится расширять этот протокол до других болезней. Первый автор Лайза Ли объясняет, «Мы показываем, что TALEN и CRISPR могут использоваться, чтобы исправить мутацию гена DMD.
Я хочу применить нуклеазы, чтобы исправить мутации для других генетических болезней как точечные мутации».