«Наши результаты показывают две главных функции PAM, которые объясняют, почему это настолько очень важно для способности Cas9 предназначаться и расколоть последовательности ДНК, соответствующие РНК руководства», говорит Дженнифер Дудна, биохимик, который привел это исследование. «Присутствие смежного PAM, чтобы предназначаться для мест в иностранной ДНК и ее отсутствии в тех целях в геноме хозяина позволяет Cas9 точно различить между несам ДНК, которая должна быть ухудшена и сам ДНК, которая может быть почти идентичной. Присутствие PAM также требуется, чтобы активировать фермент Cas9».С генетически спроектированными микроорганизмами, такими как бактерии и грибы, играя увеличивающуюся роль в зеленом производстве химии ценных химических продуктов включая терапевтические наркотики, продвинутое биотопливо и биоразлагаемые пластмассы от возобновляемых источников энергии, Cas9 появляется в качестве важного инструмента редактирования генома для практиков синтетической биологии.
«Понимание, как Cas9 в состоянии определить местонахождение определенных целевых последовательностей с 20 парами оснований в геномах, которые являются миллионами к миллиардам пар оснований долго, может позволять улучшения генного планирования и усилий по редактированию генома у бактерий и других типов клеток», говорит Дудна, который держит совместные встречи с Физическим Подразделением Биологических наук Berkeley Lab и Отделом УКА Беркли Молекулярных и Цитобиологии и Отделом Химии, и является также следователем с Howard Hughes Medical Institute (HHMI).Doudna – один из двух соответствующих авторов статьи, описывающей это исследование в журнале Nature. Бумага названа «допрос ДНК CRISPR управляемая РНК эндонуклеаза Cas9». Другой соответствующий автор – Эрик Грин из Колумбийского университета.
Созданием в соавторстве данной статьи был Самуэль Штернберг, Си Реддинг и Мартин Джинек.Бактериальные микробы сталкиваются с бесконечным нападением от вирусов и агрессивных отрывков нуклеиновой кислоты, известной как плазмиды. Чтобы выжить, микробы развертывают адаптивную основанную на нуклеиновой кислоте иммунную систему, которая вращается вокруг генетического элемента, известного как CRISPR, который обозначает Сгруппированные Короткие Палиндромные Повторения, в которых Регулярно Делают интервалы.
Через комбинацию CRISPRs и управляемых РНК эндонуклеаз, таких как Cas9, («Авария» обозначает CRISPR-связанный), бактерии в состоянии использовать маленький, настроил crRNA молекулы (для РНК CRISPR), чтобы вести планирование и ухудшение соответствия последовательностям ДНК у вторгающихся вирусов и плазмид, чтобы препятствовать тому, чтобы они копировали. Есть три отличных типа систем неприкосновенности CRISPR-аварии.
Doudna и ее исследовательская группа сосредоточились на системе Типа II, которая полагается исключительно на запрограммированный РНК Cas9, чтобы расколоть двухспиральную ДНК на целевых местах.«Что было главной загадкой в области CRISPR-аварии, то, как Cas9 и подобные управляемые РНК комплексы определяют местонахождение и признают соответствие целям ДНК в контексте всего генома, классической проблемы иголки в стоге сена», говорит Самуэль Штернберг, ведущий автор статьи Природы и член исследовательской группы Дудны. «Все ученые, которые развивают программируемый РНК Cas9 для разработки генома, полагаются на ее способность предназначаться для уникальных длинных последовательностей с 20 парами оснований в клетке. Однако, если бы Cas9 должны были просто вслепую связать ДНК наугад места через геном до столкновения с его целью, то процесс был бы невероятно отнимающим много времени и вероятно слишком неэффективным, чтобы быть эффективным для бактериальной неприкосновенности, или как инструмент для инженеров генома. Наше исследование показывает, что Cas9 ограничивает свой поиск первым поиском последовательностей PAM.
Это ускоряет темп, по которому цель может быть расположена и минимизирует время, проведенное, опрашивая нецелевые места ДНК».Doudna, Sternberg и их коллеги использовали уникальное испытание занавесок ДНК и полную внутреннюю микроскопию флюоресценции отражения (TIRFM) к изображению единственные молекулы Cas9 в режиме реального времени, когда они связали с и опросили ДНК. Технология занавесок ДНК обеспечила беспрецедентное понимание механизма целевого процесса поиска Cas9.
Результаты отображения были проверены, используя традиционную большую часть биохимическое испытание.«Мы нашли, что Cas9 опрашивает ДНК для соответствующей последовательности, используя соединение основы ДНК РНК только после признания PAM, который старается не случайно предназначаться для соответствия местам в собственном геноме бактерии», говорит Штернберг. «Однако, даже если Cas9 так или иначе по ошибке связывает с соответствующей последовательностью на ее собственном геноме, каталитическая деятельность нуклеазы не вызвана без присутствующего PAM.
С этим механизмом допроса ДНК PAM обеспечивает два избыточных контрольно-пропускных пункта, которые гарантируют, что Cas9 не может по ошибке разрушить свою собственную геномную ДНК».Примечание: образовательное видео к описанию исследования доступно в: http://www.youtube.com/watch?v=M739wgbcKuA